PCR verständlich erklärt | Funktionsweise und Anwendung

Mit PCR-Tests wird gezielt genetisches Material nachgewiesen, also bestimmte DNA- oder RNA-Sequenzen, die charakteristisch für einen Organismus, ein Virus, ein Bakterium oder ein definiertes genetisches Merkmal sind. Entscheidend ist dabei nicht das sichtbare Vorhandensein eines Keims oder Zellmaterials, sondern die Existenz einer spezifischen genetischen Sequenz.

In der Praxis kann ein PCR-Test z.B. zeigen:

• ob bestimmte Mikroorganismen in einer Probe enthalten sind,
• ob ein Lebensmittel tierischen oder pflanzlichen Ursprungs ist,
• ob genetische Veränderungen (GVO) oder Erbkrankheiten vorliegen,
• ob Sequenzen allergener Spezies in Lebensmitteln enthalten sind.

Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine standardisierte Methode, mit der ein bestimmter DNA-Abschnitt außerhalb eines lebenden Organismus vervielfältigt wird. Entwickelt wurde das Verfahren 1983 von Kary Mullis, wofür er später den Nobelpreis erhielt.

Die PCR-Reaktion läuft auf Thermocyclern, in denen die aus den Proben extrahierte DNA durch exakt definierte Temperaturzyklen geführt wird, die für die einzelnen Schritte der Reaktion notwendig sind.

Im Kern geht es darum, eine definierte genetische Sequenz innerhalb eines komplexen Gemischs aus vielen Molekülen gezielt zu erkennen und exponentiell zu vermehren. Aus wenigen Kopien eines DNA-Abschnitts entstehen innerhalb kurzer Zeit Millionen bis Milliarden Kopien.

Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass das genetische Material nicht in großer Menge aus dem Spenderorganismus gewonnen werden muss, sondern eine kleine Probe ausreicht, die „in vitro“, also außerhalb der Spender-Zelle, einfach und effektiv vermehrt werden kann.

Die hohe Sensitivität des PCR-Verfahrens macht es aber auch empfindlich gegenüber Kontaminationen. Saubere Arbeitsbedingungen, validierte Methoden und qualitätsgesicherte Prozesse sind daher entscheidend.

Für industrielle Anwendungen bedeutet das: Nur wenn das gesamte Verfahren von der Probenaufbereitung bis zur Auswertung standardisiert und gegen Kreuzkontaminationen geschützt ist, sind reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet.

Damit die PCR funktioniert, muss die Zielsequenz bekannt sein. Dafür werden spezifisch an diese Zielsequenz bindende Primer eingesetzt – kurze synthetische DNA-Stücke, die den Start- und Endpunkt des zu vervielfältigenden Abschnitts markieren.

Jeder PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten:

• Denaturierung – die DNA-Stränge werden getrennt
• Primerhybridisierung – Primer binden an die Zielsequenz
• Elongation – eine hitzestabile Polymerase verlängert die DNA-Stränge

Diese Schritte wiederholen sich 25–45 Mal. Mit jedem Zyklus verdoppelt sich die Menge des Zielabschnitts – daher der Begriff Kettenreaktion.

1. Denaturierung

Zu Beginn wird das doppelsträngige DNA-Molekül auf etwa 94–98 °C erhitzt. Durch diese hohe Temperatur trennen sich die beiden DNA-Stränge voneinander. Es entstehen zwei DNA-Einzelstränge, die als Vorlage für die anschließende Vervielfältigung dienen.
Dieser Schritt ist notwendig, damit die Ziel-DNA-Sequenz für die nächsten Schritte zugänglich wird, da die Amplifikation nur an einzelsträngiger DNA erfolgen kann.

2. Primerhybridisierung

Im nächsten Schritt wird die Temperatur abgesenkt. Nun binden die Primer an die Anfangs- und Endsequenz des zu amplifizierenden DNA-Teilstücks. Dieser Prozess wird als Primerhybridisierung bezeichnet.
Die Primer definieren exakt, welcher Abschnitt vervielfältigt wird. Sie markieren Anfang und Ende der gewünschten Sequenz. Diese Spezifität macht die PCR so präzise: Nur wenn die Primer korrekt binden, kann die Polymerase im nächsten Schritt aktiv werden.

3. Polymerase-Bindung und DNA-Synthese (Elongation)

Anschließend erhöht der Thermocycler die Temperatur auf etwa 72 °C. In diesem Bereich arbeitet die hitzestabile DNA-Polymerase optimal.

Das Enzym setzt an den gebundenen Primern an und fügt passende Nukleotide (DNA-Bausteine) an. So entsteht ein neuer komplementärer DNA-Strang. Dieser Vorgang wird als Elongation bezeichnet.
Am Ende dieses Schrittes liegt eine genetische Kopie des gewünschten DNA-Teilstücks vor.  In jedem weiteren Zyklus dienen nun auch die neu produzierten DNA-Teilstücke als genetische Vorlage für die weitere Amplifizierung. Somit erfolgt eine exponentielle Vervielfältigung des gewünschten DNA-Teilstücks.

4. Repetition des Vorgangs: Die eigentliche Kettenreaktion

Die eigentliche Funktionsweise der PCR liegt in der Wiederholung der oben genannten Schritte. Jeder Zyklus besteht aus exakt definierten Temperaturwechseln, die im Thermocycler programmiert sind. Bereits nach 30 Zyklen entstehen theoretisch aus einem einzigen Molekül DNA über eine Milliarde Kopien des Zielabschnitts.

Neben der klassischen Methode haben sich verschiedene Varianten der PCR etabliert, um die Anwendungsfelder zu erweitern.

In Analyselaboren wie denen der Tentamus Group wird besonders für komplexe Proben oft die Real-Time PCR eingesetzt. Diese Technik eignet sich besonders für höchste Genauigkeit sowie quantitative Aussagen, da die Reaktion in Echtzeit verfolgt werden kann.

qPCR (quantitative Polymerase-Kettenreaktion)

Die qPCR kombiniert Amplifikation und Echtzeitmessung. Sie erlaubt nicht nur den Nachweis, sondern auch die präzise Bestimmung der Ausgangsmenge. Dies ist möglich, indem mithilfe fluoreszierender Marker die Menge an DNA schon während der PCR selbst monitoriert und dokumentiert wird.

Dabei wird oft die Sondentechnologie eingesetzt. Eine Sonde ist ein kurzer, markierter DNA-Abschnitt, der ebenfalls spezifisch an die Zielsequenz bindet. Während der PCR wird diese Sonde durch die Polymerase abgebaut, wodurch ein Fluoreszenzsignal freigesetzt wird.

Die qPCR hat einige Vorteile:

• erhöhte Spezifität, da zusätzlich zu den Primern eine dritte Sequenz exakt passen muss
• Echtzeit‑Detektion (Real-Time PCR): Die Fluoreszenz steigt proportional zur Menge des amplifizierten Produkts
• Quantifizierung: Es lässt sich nicht nur feststellen, ob eine Sequenz vorhanden ist, sondern auch wie viel

RT-PCR (Reverse Transkriptase PCR)

Die RT-PCR erweitert den Anwendungsbereich der klassischen DNA-basierten PCR auf RNA-Ausgangsproben. Hierfür wird zunächst RNA in DNA mithilfe des Enzyms „Reverse Transkriptase“ umgeschrieben. Erst danach erfolgt die klassische Amplifizierung mittels PCR. Dieses Verfahren ist essenziell beim Nachweis von RNA-Viren, wie z.B. SARS-CoV-2 während der Corona-Epidemie.

Nested PCR

Bei der Nested PCR werden zwei aufeinanderfolgende Amplifikationsrunden mit unterschiedlichen Primern durchgeführt, wobei das zweite Set Primer innerhalb des in der ersten PCR amplifizierten Teilstücks binden. Die amplifizierten Teilstücke der ersten PCR dienen hierbei als Aufgangsmaterial für die 2. PCR. Da die inneren Primer an das spezifische Produkt der ersten Reaktion binden müssen, ist es sehr unwahrscheinlich, dass unspezifische Produkte aus der ersten Runde erneut amplifiziert werden. Die Nested PCR ist daher hochspezifisch und wird eingesetzt, wenn nur sehr wenig Ausgangsmaterial vorhanden ist.

Das Prinzip der PCR eignet sich für qualitative und quantitative Untersuchungen. Während die klassische PCR dem qualitativen Nachweis einer Sequenz dient, wird eine abgewandelte Form der PCR, die qPCR, eingesetzt, um einen hochsensiblen qualitativen Nachweis erbringen zu können.

Qualitativer Nachweis

Bei der klassischen PCR erfolgt die Auswertung häufig über eine Gelelektrophorese. Hierfür werden alle im Reaktionsansatz enthaltenen DNA-Fragmente in einem Gel-Trägermaterial über ein elektrisches Feld nach Länge getrennt und über ein Färbeverfahren sichtbar gemacht.

Als positives Ergebnis wird eine DNA-Bande im Gel-Träger gewertet, die anhand eines Größenstandards als DNA-Teilstück mit der erwarteten Länge identifiziert werden kann.

Qualitative Anwendungen betreffen vor allem den Nachweis bestimmter Organismen oder genetischer Merkmale. Typische Anwendungen sind:

• Nachweis pathogener Keime in Lebensmitteln
• Identifikation von Allergenen
• GVO-Nachweise
• Identifizierung bestimmter Pflanzen- oder Tierarten
• Nachweis von Virusinfektionen

Quantitative Methoden

In vielen industriellen Anwendungen ist jedoch nicht nur entscheidend, ob eine Sequenz vorhanden ist, sondern in welcher Menge.

Hier kommt die qPCR (quantitative PCR) zum Einsatz. Diese misst die Amplifizierung bereits während der laufenden Reaktion mithilfe fluoreszierender Marker. Dadurch lässt sich die tatsächliche Ausgangsmenge der DNA berechnen.

Referenzmaterialien und Kalibrierkurven ermöglichen eine präzise Quantifizierung. Gerade bei einzuhaltenden Grenzwerten ist das entscheidend, etwa in der Lebensmittelanalytik. So kann beispielsweise bestimmt werden, ob ein Grenzwert überschritten ist oder ob eine Charge freigegeben werden kann.

Typische Anwendungsfälle sind:

• Einhaltung von Grenzwerten in den Lebensmittelanalytik
• Bestimmung mikrobieller Belastung
• Quantifizierung von Keimen in kosmetischen Rohstoffen
• Monitoring von Produktionsprozessen

Die PCR ist heute ein ubiquitäres Werkzeug für eine Vielzahl von Anwendungsfällen geworden. Mit Hilfe der schnellen, einfachen und vergleichsweise kostengünstigen Amplifizierung genetischen Materials sind Analysen und Nachweise von DNA inzwischen alltäglich geworden.

Forschung

In der biologischen Forschung ist die PCR eine zentrale Methode, um definierte DNA-Abschnitte gezielt zu vervielfältigen und zu analysieren. Sie ermöglicht die Identifikation von Genen, die Untersuchung von Mutationen und bildet häufig die Grundlage für weiterführende Verfahren wie die Sequenzierung oder Klonierung.

In der Grundlagenforschung hilft sie dabei, regulatorische Mechanismen auf molekularer Ebene zu verstehen, während sie in der angewandten Forschung zur Entwicklung neuer diagnostischer Verfahren, Impfstoffe oder biotechnologischer Produkte beiträgt. Durch ihre hohe Sensitivität und Spezifität ist die PCR aus modernen Labor-Methoden nicht mehr wegzudenken.

Medizin und diagnostische Anwendungen

In der medizinischen Diagnostik ist die PCR ein Standardverfahren. Besonders bekannt wurde die RT-PCR (eine Variante der klassischen PCR) beim Nachweis von SARS-CoV-2 während der COVID-19-Pandemie.

Auch bei der Erkennung von Erbkrankheiten oder genetischen Mutationen spielt die Methode eine tragende Rolle.

Lebensmittelanalytik

Für Lebensmittelhersteller ist der schnelle Nachweis von Kontaminationen entscheidend. Die PCR ermöglicht es, pathogene Bakterien bereits in sehr frühen Stadien nachzuweisen. Das Verfahren ist dabei deutlich schneller als klassische Verfahren, in denen mikrobielle Verunreinigungen durch Anzucht identifiziert werden.

Auch bei der Artendifferenzierung und zur Authentizitätsprüfung, etwa zur Vermeidung von Lebensmittelbetrug, wird die PCR eingesetzt. Durch gezielte Sequenzanalyse lassen sich tierische oder pflanzliche Bestandteile eindeutig identifizieren.

Kosmetikindustrie

In der Kosmetikindustrie unterstützt die PCR die mikrobiologische Sicherheit. Rohstoffe, Zwischenprodukte und Fertigwaren können auf spezifische Keime untersucht werden und dienen so der Absicherung regulatorischer Anforderungen.

Forensik und biologische Anthropologie

In der Forensik ermöglicht die PCR die Analyse genetischer Fingerabdrücke. Selbst minimale Spuren genetischen Materials reichen aus, um die DNA analysieren und Täter überführen zu können.

Auch in der Paläontologie können DNA-Fragmente aus Fossilien mithilfe der PCR vervielfältigt, anschließend sequenziert und analysiert werden, um Rückschlüsse auf genetische Verwandtschaft ziehen zu können.

Die PCR ist eine leistungsstarke Methode – ihre Aussagekraft hängt jedoch maßgeblich von der korrekten Durchführung, validierten Verfahren und qualifizierten Fachkräften ab.

Unsere Labore arbeiten mit modernen Thermocyclern, validierten PCR-Methoden und streng kontrollierten Qualitätsstandards nach DIN EN ISO/IEC 17025, die einen hervorragenden Schutz vor Kreuzkontaminationen bieten.

Wir unterstützen Sie bei:

• Entwicklung geeigneter PCR-Strategien
• Qualitativen und quantitativen Nachweisen
• Validierung neuer Produkte
• Unterstützung bei regulatorischen Anforderungen

Ob mikrobiologischer Nachweis, GVO-Analyse, Allergenanalysen oder spezifische Tierartennachweise, wir begleiten Sie von der Fragestellung bis zur belastbaren Entscheidungsgrundlage.

Sie möchten mehr über PCR-Analysen erfahren oder ein konkretes Probenmaterial prüfen lassen?
Kontaktieren Sie uns – wir beraten Sie persönlich und entwickeln gemeinsam das passende Verfahren für Ihre Anforderungen.